柱壓反映了色譜柱的內(nèi)部狀況，所以是 HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時(shí)進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就已報(bào)廢了。

　　柱壓波動(dòng)的原因及解決辦法

　　和柱壓波動(dòng)相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板(inlet frit)以及其后面1-2cm長(zhǎng)度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況：

　　1、填料破碎和使用后有填料粉末生成

　　填料破碎一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過打開承壓的后篩板，對(duì)柱床會(huì)有不好影響。

　　2、顆粒物堵塞引起柱壓上升和對(duì)策

　　可能堵塞進(jìn)口端篩板(前篩板)和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品(制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入)、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動(dòng)相(溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入)、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出(一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致)。

　　水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)避免將這類流動(dòng)相在室溫下久放，可放入冰箱存放。

　　(1)預(yù)防措施

　　樣品(甚至標(biāo)準(zhǔn)品)和流動(dòng)相過濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45μm孔徑濾膜過濾樣品和流動(dòng)相，對(duì)使用2μm以下填料的超高壓柱的，可用0.20μm濾膜。濾膜材質(zhì)有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。

　在線過濾器內(nèi)裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2μm和0.5μm兩種。安裝位置有兩個(gè)可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對(duì)樣品和流動(dòng)相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對(duì)流動(dòng)相有過濾作用。

　　保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過濾顆粒物的作用。

　　(2)故障排除

　　反沖色譜柱：不連接檢測(cè)器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時(shí)反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時(shí)顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對(duì)效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑(2-5μm)的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。

　　換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會(huì)帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過如果反沖不能解決問題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報(bào)廢了。

　　如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵。

　　3、化學(xué)污染物引起柱壓上升和對(duì)策

　　來源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染普遍，特別是對(duì)復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候?；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。

　　像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測(cè)器一般對(duì)此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。

　　保留能力中等的污染物，會(huì)被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移。

　　對(duì)強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積。有時(shí)，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對(duì)分析物起作用，引起保留時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會(huì)堵塞填料間隙，引起柱壓上升。好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對(duì)填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。

　　(1)預(yù)防措施：

　　a.制樣時(shí)采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)清除掉；

　　b.連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應(yīng)與分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱的功效。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時(shí)，也不能說不可再清洗后復(fù)用，但價(jià)格低不值得去花這個(gè)時(shí)間。

　　c.經(jīng)常對(duì)分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)。

　　(2)故障排除：

　　已經(jīng)累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡(jiǎn)單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱100%甲醇---100%乙晴---75%乙晴/25%異丙醇---100%異丙醇---100%二氯甲烷---100%正己烷用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2mL/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動(dòng)相體系。

　　對(duì)受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時(shí)還加上離子對(duì)試劑等組成的配方清洗效果很好，譬如用水溶液和丙醇溶液對(duì)柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來再生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm×4.6mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。

　　清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對(duì)油脂類物質(zhì)，可用異丙醇清洗。